Le malattie genetiche rare rappresentano un insieme estremamente eterogeneo di condizioni patologiche che, in molti casi, rimangono prive di una diagnosi definitiva, limitando i pazienti a trattamenti esclusivamente sintomatici.

Le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione, in particolare il sequenziamento dell’esoma (la parte del DNA che contiene i geni che producono proteine), hanno consentito di individuare numerosi geni responsabili di queste patologie, chiarendone i meccanismi molecolari. Tuttavia, questa analisi non permette di rilevare varianti patogenetiche localizzate nelle regioni non codificanti del genoma. Di conseguenza, circa il 50% dei pazienti con sospetta malattia genetica rara rimane senza una diagnosi molecolare certa e non può accedere ai benefici della medicina personalizzata.

Il sequenziamento dell’RNA rappresenta un approccio complementare, perché consente di analizzare sia le variazioni di sequenza sia le alterazioni dei livelli di espressione genica. In questo modo è possibile ottenere informazioni complementari rispetto alla sola analisi del DNA e aumentare le possibilità di diagnosi. Poiché l’espressione genica è strettamente dipendente dal tipo di tessuto, il campione più informativo sarebbe quello proveniente dall’organo colpito. Tuttavia, il suo prelievo non è sempre possibile o può risultare eccessivamente invasivo. In tali situazioni, è possibile ricorrere a tessuti alternativi facilmente accessibili. I fibroblasti derivati da biopsie cutanee rappresentano una valida opzione: numerosi studi ne hanno dimostrato l’utilità in diverse categorie di patologie, tra cui malattie neuromuscolari, mitocondriali e del neurosviluppo. Il presente progetto si propone di individuare, attraverso l’analisi dell’RNA, le alterazioni molecolari responsabili di malattie rare ancora non diagnosticate in pazienti neonatali, pediatrici e adulti con esordio precoce della malattia, risultati negativi al sequenziamento dell’esoma. A questo scopo, è stato ottimizzato un protocollo per l’isolamento di fibroblasti a partire da piccole biopsie cutanee in un gruppo di controlli sani. Le cellule ottenute sono state caratterizzate mediante analisi morfologica e immunofluorescenza per verificare l’espressione di marcatori specifici dei fibroblasti, garantendo la purezza cellulare. L’RNA è stato estratto e sottoposto a valutazione qualitativa e di integrità e, successivamente, sequenziato. Abbiamo poi ottimizzato un protocollo di analisi dei dati che ci ha permesso di stabilire il passaggio cellulare più idoneo per l’analisi dell’RNA.

Attualmente stiamo validando il protocollo in un gruppo di pazienti con alterazioni note dell’espressione di specifici geni. Una volta completata questa fase, si procederà con l’applicazione del protocollo in ambito diagnostico, attraverso il reclutamento di pazienti sintomatici non diagnosticati, con sospetta patologia genetica ed esoma negativo.

A tal proposito, abbiamo reclutato 23 pazienti ad oggi senza diagnosi. Grazie alla profonda sinergia e collaborazione con i Medici del nostro Centro Clinico Aldo e Cele Daccò, siamo riusciti a identificare per 12 di loro la causa genetica alla base della patologia. I restanti 11 pazienti si sono sottoposti a biopsia cutanea e, dopo averne isolato i fibroblasti, abbiamo estratto l’RNA, pronto per essere sottoposto ad analisi di sequenziamento.

Grazie al fondamentale supporto della Fondazione A.R.M.R., ho potuto avviare, sviluppare e portare avanti per il quarto anno un progetto di ricerca strategico nel campo delle malattie rare non diagnosticate presso l’Istituto Mario Negri, ponendo le basi per future applicazioni diagnostiche innovative e per un concreto avanzamento della medicina personalizzata.

Annamaria Morotti